1. Jak przygotować matrycę do sekwencjonowania

Przygotowanie DNA do sekwencjonowania

• DNA genomowe zawieszone w wodzie (nie mniej niż 15μl na reakcje) o stężeniu:

(zdjęcie do wgrania)

• Produkt reakcji PCR powinien być oczyszczony od mieszaniny reakcyjnej (dNTP, startery, bufor,polimeraza), np. za pomocą kolumienek lub zestawem ExoSap i zawieszony w wodzie.
• Primer o stężeniu 5 pmoli/μl (5μM) w objętości nie mniej niż 15μl na reakcje.
• Matryce i startery są przechowywane w pracowni przez miesiąc, licząc od daty wysłania wyników; po tym czasie nieodebrane preparaty są utylizowane.

Do zlecenia należy dostarczyć zdjęcie żelu z dokładnym opisem próbek (ile μl naniesiono na żel,wielkość produktu czy plazmidu, stężenie matrycy).

2. Opis matrycy

Każdy formularz zlecenia należy bardzo dokładnie wypełnić drukowanymi literami wraz z odpowiednim opisem próbek do sekwencjonowania. Opis powinien mieć wypełnione pola dotyczące: ID matrycy (nazwa próbki klienta), rodzaj matrycy (produkt PCR, DNA genomowy, plazmid, cosmid, BAC), wielkość matrycy, nazwa primera oraz stężenie matrycy. W rubryce „ usługa” należy wybrać rodzaj usługi, zaś w rubryce  „uwaga” należy wpisać dodatkowe informacje dotyczące próbek: m.in. sposób czyszczenia próbek (ExoSap, kolumienki, etanol). Można także podać temperaturę annealingu Tm startera.

3. Przesłanie matrycy

Próbki należy przesyłać przesyłką kurierską lub za pośrednictwem Poczty Polskiej w kopercie
z wypełnieniem powietrznym. Matrycę i startery najlepiej umieścić w oddzielnych torebkach
strunowych. Próbki do sekwencjonowania i startery są stabilne w temperaturze pokojowej przez kilka dni, zatem można je przesyłać bez wkładów chłodzących.

Uwaga!

Koszty przesyłki pokrywa zleceniodawca.
W przypadku większej liczby zleceń (powyżej 10 próbek do sekwencjonowania, lub całej płytki z terenu Poznania oraz powyżej 20 próbek lub całej płytki z pozostałych miejscowości) CBDNA pokrywa koszty przesłania materiału przesyłką kurierską UPS-standard z terenu całego kraju lub przesyłka kurierską - Maraton z terenu miasta Poznania.

4. Dobór odpowiedniego startera

• optymalna długość 18 - 24 nt
• zawartość par G i C 40-60%
• zrównoważony rozkład nukleotydów GC i AT
• temperatura topnienia startera powinna wynosić od 50-60 °C
• nie używać starterów tworzących struktury drugorzędowe lub dimery.

Parametry swoich starterów mogą Państwo sprawdzić na dostępnych stronach www:

• Primer-Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
• Oligo Calculator http://trishul.sci.gu.edu.au/tools/OligoCalculator.html
• Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi

lub samodzielnie:

• Tm=(ilość zasad A+T) x 2°C + (ilość zasad G+C) x 4°C

Poniższa formuła pozwala wyznaczyć orientacyjne stężenie oligonukleotydu:

• C (pmol/μl lub μM) = (A260x100)/(1.54nA+0.75nC+1.17nG+0.92nT)

gdzie: C – stężenie, nx - liczba zasad typu x w oligonukleotydzie

5. Sekwencje starterów dostępnych w Pracowni Sekwencjonowania